基金项目:辽宁省科学技术基金项目（Ｎｏ．２００４１０３３）
作者单位：沈阳医学院，
辽宁沈阳110034；沈阳市铁西区疾控中心理化实验室
vestigation on the Expression of NMDA Receptor Subunit (NR1、NR2A、NR2B) in Different Brain Areas of Plumbum Exposure Rats
ZHU Qiｗen, ZHANG Qi(Shenyang Medical College, Shenyang 110034,China;Physics＆hemistry Clinical Laboratory， Diseases Control Centre of Tiexi District of Shenyang)
【摘要】目的：观察铅暴露大鼠中不同脑区NMDAR1（NR1）、NMDAR2A（NR2A）和NMDAR2B（NR2B）亚基蛋白和mRNA水平的表达情况。方法：采用Western Blot及RTPCR技术，测定NR1、NR2A和NR2B亚基蛋白和mRNA在铅暴露大鼠脑中额叶皮质、新小脑、海马及纹状体中的表达情况。结果：铅暴露大鼠中NR1、NR2A和NR2B亚基的蛋白水平和mRNA表达在各个脑区均有不同程度的下调。结论：在铅暴露大鼠的额叶皮质、海马、新小脑和纹状体中，NMDA受体亚基NR1，NR2A和NR2B的表达在mRNA水平就已经发生了改变。
【关键词】 AD（Alzheimer，s disease，阿尔茨海默症）；NR1亚基；NR2A亚基；NR2B亚基
Ａｂｓｔｒａｃｔ Objective：To investigate the change ofNMDAR1（NR1）,NMDAR2A（NR2A）and NMDAR2B（NR2B）subunit expression in the different brain region of plumbum exposure rat.Methods:Western blot technique and RT-PCR technique were used to determine the expression of NR1,NR2A and NR2B subunit protein and mRNA expression in Pb exposure rats brain cortex of frontal lobe, neocerebellum, hippocampus and corpora.Results:The levels of NR1, NR2A and NR2B subunit protein and mRNAs expression in different regions of the brain from Pb exposure rats had different degree down regulation. Conclusion:The expression of NMDA receptor subunit NR1,NR2A and NR2B had changed at mRNA level in the cortex of frontal lobe，neocerebellum，hippocampus and corpora striata from Pb exposure rats.
Key words Alzheimers disease ( AD) ;NR1 subunit; NR2A subunit; NR2B subunit
N-甲基-D-天门冬氨酸（NmethyD-aspartate，NMDA）受体是离子型谷氨酸（Glutamatic acid）受体的一个亚型，通过对其药理、生理、病理等方面的研究已经证实，NMDA受体在生物发育过程中有着重要的生理作用，可调节神经元的活性，树突、轴突结构的发育及突触可塑性等，在神经元回路的形成及学习和记忆的突触机制中，NMDA受体也起着关键作用[1～4]。正常神经系统的发育需要兴奋性氨基酸受体活性处于最佳水平，如果NMDA受体活性过低则可能使发育延迟，而活性过高又可能导致神经元损伤或脑损伤[5～7]。本研究采用了铅暴露大鼠模型，研究NMDA受体在铅暴露大鼠学习记忆障碍中的变化，探讨其可能的机制。
1 材料与方法
1.1 动物及模型制备40只一月龄SpragueDawley（SD）大鼠由沈阳医学院实验动物中心提供，雌雄不拘，体重（120±15）g，随机分成5组，各8只。铅暴露组分饲0.1%、0.2%、0.5%、1.0%用蒸馏水配制的醋酸铅溶液，对照组给予蒸馏水。3周后娩出子鼠，子鼠21天起断乳，喂以母鼠相同的饮水并单独饲养。当母鼠18个月龄时，采用朱启文等先前报道过的大鼠多功能行为训练装置[8]，在术前及术后14d开始被动回避反应（passive avoidance response，PAR）训练。将铅暴露大鼠模型合格者处死取脑标本进行下列实验。
1.2 方法
1.2.1 Western Blot 分析 （1）试剂：NR1、NR2A多克隆抗体购于santa cruz公司；NR2B购于博士德生物工程有限公司；辣根过氧化物酶标记兔抗羊和羊抗兔抗体购于中山公司。（2）样品处理：取大鼠不同脑区标本，切取一部分，裂解脑组织提取总蛋白。上样，电泳，湿转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭。将PVDF膜在置于4℃NMDA受体杂交液（1：500）中摇床过夜，然后在过氧化物酶标记二抗（IgG）杂交液（1：5000）中孵育1h。最后ECL发光显影。
1.2.2 组织总RNA的提取及RTPCR（1）试剂：RNeasy Mini Kit试剂盒购于QIAGEN公司。RTPCR试剂盒购于Takara公司。（2）样品处理：按试剂盒步骤提取总RNA，紫外分光光度计测定，计算总RNA的浓度。反转录后以βactin为内参进行扩增。PCR扩增片断长度为：NR1463bp，NR2A421bp，NR2B651bp，βactin445bp。取PCR产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳后染色，成像。
1.3 统计学分析采用t检验进行统计学处理。
2 结果
2.1 Western Blot结果铅暴露大鼠海马区NR1、NR2A、NR2B亚基蛋白表达明显减弱，额叶皮质和纹状体次之，经统计学处理差异有显著性（P＜0.05），新小脑区无明显减弱（P＜0.5）（图1～3）。
2.2 RTPCR检测结果正常对照组大鼠NR1、NR2A亚基mRNA表达新小脑较强（P＜0.05），其余各区无差异，NR2B亚基mRNA额叶皮质及新小脑表达较强（P＜0.05）。铅暴露大鼠组三种亚基的mRNA表达均有不同程度的下调。铅暴露大鼠中各区NR1亚基mRNA表达均有所降低，其下调趋势趋于一致（P＜0.05）（图4）；NR2A亚基mRNA在铅暴露大鼠中额叶皮质、新小脑区、海马及纹状体的表达下调趋势均很明显（P＜0.05）（图5）；NR2B亚基在额叶皮质、新小脑区的表达趋势下降最显著，纹状体次之（P＜0.05），海马最次之（图6）。
3 讨论
兴奋性氨基酸（EAA）受体有三种亚型：海人草酸（KA）受体，使君子氨酸（QA）受体和N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体。NMDA受体通道只在学习记忆过程中才开启，因此被认为是学习记忆中的关键物质。NMDA受体不仅调节Na+、K+通道，还控制Ca2+通道。当被激活时，有跨膜Na+K+流动，也有大量Ca2+流入胞内。Ca2+可作为第二信使，可能直接或间接使膜受体发生改变，从而改变突触效率，产生记忆[9]。
Martin等报道，利用Western Blott方法证实16位AD患者死后大脑四个不同脑区NR1，NR2A和NR2B蛋白磷酸化水平与患者死前认知反应行为测试正相关，且NR1和NR2B在海马减少，在枕叶及尾核却未见减少[10,11]。
图1 铅暴露大鼠和正常对照大鼠NR1亚基Westernblot检测结果（略）
图2 铅暴露大鼠和正常对照大鼠NR2A亚基Western blot检测结果（略）
图3 铅暴露大鼠和正常对照大鼠NR2B亚基Western blot检测结果（略）
图4铅暴露大鼠和正常对照大鼠NR1亚基RTPCR检测结果（略）
图5 铅暴露大鼠和正常对照大鼠NR2A亚基RTPCR检测结果（略）
图6 铅暴露大鼠和正常对照大鼠NR2B亚基RTPCR检测结果（略）
Sze等报道，采用RTPCR技术证实9位AD患者死后大脑中NR2A和NR2B亚基mRNA的水平在海马和内嗅皮质中是降低的，NR1亚基的mRNA水平在受试者的三个脑区中是相似的，在小脑，三种亚基的mRNA水平却未见减少，且这种变化是与年龄和死后延搁无关[12]。
本实验研究结果表明，NR1，NR2A和NR2B的蛋白水平和mRNA水平在铅暴露大鼠的额叶皮质、海马、新小脑和纹状体中均是降低的。表明在铅暴露大鼠中，NMDA受体亚基NR1，NR2A和NR2B的表达在mRNA水平就已经发生了改变，为进一步研究降低的NR1,NR2A和NR2B亚基水平和学习和记忆能力降低之间的联系，探索NMDA受体亚基在学习和记忆中的作用，提供了理论依据。
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